弗莱明意识到他应该聚焦于杀死有害菌，为此于1927年开始了大规模培养葡萄球菌，后用一年多时间筛选抗菌物质，却还是毫无进展。俗话说“眼不见心不烦”，为此弗莱明决定放下当前烦心事全家进行度假，鉴于工作还要继续的原则，走之前弗莱明接种了多皿葡萄球菌，将培养皿放置在实验室角落里的长凳上以便回来后可以立即使用。

1928年9月3日，弗莱明在度过愉快的假期后重回实验室工作，在检查培养皿过程中意外发现一个培养皿被真菌污染，真菌周围出现了一个透明的圆圈形状，而远处的葡萄球菌还在茁壮生长。他当时认为这个现象很有趣，后在同事提示下意识到，这不就是溶菌酶的翻版吗？但与溶菌酶的最大不同在于这次杀死的是有害菌。

弗莱明随后确定造成“污染”的真菌属于青霉属，因此将最初命名的抗菌物质由“真菌汁”修改为“青霉素”，意指青霉菌产生的物质。弗莱明需要进一步确认青霉素杀死葡萄球菌是偶然现象还是普遍现象，因此对青霉菌进行单独培养。测试结果表明，青霉菌对部分细菌如葡萄球菌、链球菌、炭疽杆菌等都具有杀伤性，而对其他细菌如大肠杆菌和霍乱弧菌等则没有杀伤性。弗莱明还发现青霉素和溶菌酶存在诸多不同，如青霉素只能由青霉菌产生（其他真菌无效），而溶菌酶广泛存在；二者能杀死的细菌种类也存在巨大差异。

实际上，弗莱明并非第一位观察到青霉菌具有抑制细菌生长现象的科学家，但只有弗莱明抓住了这一现象并进行了深入研究。有人将青霉素的偶然发现归结于弗莱明的幸运，这是非常不客观的描述，因为弗莱明已花费十余年寻找抗菌物质，而青霉素的特性与前期的溶菌酶又出奇地相似，因此弗莱明能抓住这一意外事件并最终发现青霉素，可看作是他长期坚持的结果。正如巴斯德所说，机遇只偏爱那些有准备的头脑。如果弗莱明没有认真细致地观察，而只是无动于衷、放之任之，不抓住那些偶然现象，也就不会发现溶菌酶和青霉素。而弗莱明发现并研究青霉素的器具，今天被保存在圣玛丽医院的亚历山大弗莱明实验室博物馆。

1929年，弗莱明在《英国实验病理学杂志》上发表《关于青霉菌培养物的抗菌作用，特别是在分离流感嗜血杆菌中的应用》，全面介绍青霉素的特点及潜在用途，即将来“能用于治疗细菌感染”，但他更多强调的是青霉素的当前用途——作为一种单纯的技术工具，用以区分培养基中对青霉素敏感的细菌和耐药细菌。青霉素音译名为“盘尼西林”，主要通过破坏细菌的细胞壁生成而发挥抗菌活性，由于人体细胞都没有细胞壁，因此青霉素对白细胞等毒副作用较小，动物和临床实验也证实青霉素是一种高效、低毒的抗生素。