青霉素的命运和溶菌酶差别不大，也未引起同行太多关注。青霉素首先需要解决的问题是分离和提纯，后续才是大规模生产。因为少得可怜的青霉素对于大量需求者而言是杯水车薪。弗莱明继续研究青霉素，决定与化学家合作来完成提纯。弗莱明首先联系了包括英国医学研究委员会实验室化学系主任哈罗德·金在内的几位化学家，但收效甚微；又于1932年和真菌代谢物领域著名的生物化学家哈罗德·赖斯特里克组建合作团队，但只分离到色素成分，未获得抗菌物质。1935年，赖斯特里克在一次学术会议上提到，想要大规模生产医疗用途的青霉素，几乎是不可能的。至此，大家普遍认为弗莱明的发现太难实践，花费巨大资源都无法分离到足够量的青霉素，总不能在病人体内通过培养青霉菌来直接产生青霉素。

弗莱明关于青霉素的发现被埋没了十余年。1936年，弗莱明在医学研究俱乐部会议上谈及青霉素在治疗人类感染方面的潜在价值时，并无同行问津；在随后的国际微生物学大会上，面对来自世界各地的著名细菌学家们，他再次提到青霉素发现的重要性，可回应者还是寥寥无几。当时，几乎整个科学界都对青霉素在预防和治疗人类感染疾病方面的潜在应用没有太多兴趣。

客观上讲，大家并非刻意忽视弗莱明的发现，实在是因为该发现在实际应用中的瓶颈迟迟无法取得突破。同期，德国微生物学家格哈德·多马克于1932年发现磺胺药——百浪多息，其抗菌作用迅速引起科学界的普遍关注。1939年，多马克被授予诺贝尔生理学或医学奖。

青霉素的命运的最终转变，是在霍华德·弗洛里和厄斯特·钱恩两位科学家手下实现的。

1935年，牛津大学病理学教授弗洛里招聘生物化学家钱恩加入实验室，他们志趣相投，都对抗菌物质有浓厚兴趣。二人发现弗莱明关于溶菌酶的文章并于1937年提纯溶菌酶；后又发表青霉素文章并决定研究青霉素价值。

1939年，弗洛里和钱恩向英国医学研究委员会申请基金用以支持青霉素研究。尽管同意资助，但由于英国当时刚向德国宣战，因此只能提供最低限度的资金。项目随时面临突然停止的窘状，幸运的是，弗洛里又从美国洛克菲勒基金会获得了足够资助得以使项目继续。钱恩负责青霉素提纯，弗洛里主持青霉素抗菌活性的动物实验。1939年5月25日，弗洛里为8只小鼠注射致病性链球菌，4只小鼠未做进一步处理，剩余4只注射青霉素；次日未做进一步处理的小鼠全部死亡，而注射了青霉素的小鼠都健康活着。弗洛里认为青霉素在抗菌方面看起来很有效，而钱恩直接惊呼这个结果简直就是一个奇迹。经过重复实验和验证后，他们最终确认青霉素是一种具有重要抗菌作用的潜在药物。这一结果于1940年8月24日发表于《柳叶刀》杂志，从而为抗生素研究掀开新的篇章。

弗莱明读到弗洛里的论文后兴奋异常，第一时间联系弗洛里安排会面，共同推进青霉素研究。1942年8月，弗莱明从弗洛里团队获得了数量不多的青霉素纯品，并为患有致病性链球菌脑膜炎的哈里·兰伯特进行了首次治疗，第二天症状就显著改善，一周后完全康复。该结果于1943年发表于《柳叶刀》杂志上，正式确认了青霉素的临床治疗价值。然而，青霉素的实验室制备量远远无法满足实际需求，弗洛里在劝说英国政府未果后来到美国，最终成功实现了青霉素的工业化。1945年6月，青霉素的年生产能力已达到6460亿单位。

青霉素的作用立竿见影，一定程度上影响了第二次世界大战的走势，是盟军取得最终胜利的原因之一。青霉素的应用直接减少了“二战”期间军队因为感染而造成的截肢和死亡人数；再以细菌性肺炎为例，第一次世界大战期间患者死亡率为18%，而在第二次世界大战期间由于青霉素的使用而使死亡率降低到不足1%。由于青霉素的应用广泛，因此它挽救生命的确切数字可能难以确定，估计应该在8000万到2亿之间，堪称人类和医学发展史上的奇迹，因此青霉素的发现和应用具有里程碑意义。

随后，其他研究人员使用类似方法和生产技术又发现了多种具有杀菌作用的物质，如链霉素、氯霉素和红霉素等，它们也拥有了一个共同的名字——抗生素。弗莱明的贡献不仅仅在于发现青霉素，更在于开创了抗生素领域。