尽管公共卫生策略在减少结核病传播方面取得了一定成效，但结核病长期居高不下的死亡率仍让科赫难以释怀。因此，科赫决定接受更大挑战，那就是找到结核病的治疗良策。这个挑战在当时的历史背景下（大多数疾病的治疗方法有限）确实巨大，最终导致科赫的这次尝试以失败告终。

1888年，科赫研发出一种体外检测结核杆菌活性的快速方法，随后启动了抗菌化合物的筛选工作。他在随后两年时间内先后测试了数百种化合物，遗憾的是均以失败告终。1890年2月，科赫意外发现结核杆菌培养物可治愈豚鼠的肺结核，他进一步确定这种活性成分为结核菌素。此时，科赫过度自信、急于求成和些许不严谨的作风开始显现，在治疗过程中豚鼠表现出的严重副作用并未引起他的重视。

1890年8月，科赫在第10届国际医学大会上做了一个学术报告。临近尾声时，他宣布找到了一种治疗结核病的化合物。这一振奋人心的消息立刻轰动了整个会场，并随后扩散到全球，多家著名媒体都报道了这一重大突破。世界各地的结核患者慕名来到柏林接受这种治疗方法，许多医生也纷纷开展学习。可是，后续的发展却完全超出了科赫的预期，接受结核菌素治疗的患者并未痊愈，甚至由于严重副作用而导致患者死亡。这一结果报道后，科赫的研究遭到了公众的强烈质疑，德国政府也对整个研究过程启动了全面调查，最终于1891年底正式宣布结核菌素治疗结核病无效。这一事件令科赫的国际声誉受到严重打击，也成为他科研生涯的滑铁卢。尽管结核菌素后来在结核诊断方面发挥了重要作用，但仍无法消除科赫在整个事件中的重大失误。

科赫的失败有重要历史原因，那就是人类急于想攻克结核病这一顽疾，但以当时的客观条件，根本无法实现。结核治疗直到1947年链霉素的发现才有根本性改变，后来又有异烟肼和利福平等药物的应用，但这些很大程度上得益于科赫结核杆菌的发现。