1849年9月26日，巴甫洛夫出生于俄国中部的小城市梁赞。他的父亲是俄国东正教的一位乡村牧师，和身为家庭主妇的母亲共生育了11个孩子。巴甫洛夫是这11个孩子中的老大，从小养成了独立自主的性格。

所谓穷人的孩子早当家。因为家境贫寒，巴甫洛夫从小便开始帮助母亲干家务，例如洗碗和照顾他的弟弟妹妹。虽然每天的生活都被安排得满满的，但他依然拥有广泛的爱好，喜欢园艺、骑自行车、划船、游泳和阅读。天资聪慧的他，年仅7岁便能独立自主阅读各类书籍，经常攀爬到阁楼上阅读父亲的藏书，从小便接触到赫尔岑、车尔尼雪夫斯基等革命思想家的进步著作。在这些人的影响下，他从小便在心中埋下了唯物主义的种子。

一次贪玩，他从高墙上跌落，在石路上摔成了重伤，一直推迟到11岁才正式上学。但因为已经掌握了小学的基础知识，父亲便安排巴甫洛夫进入了梁赞教会中学，期待他在未来子承父业，成为一名牧师。

1864年，中学毕业后，15岁的巴甫洛夫在父亲的希望下成功进入了梁赞教会神学院。按照正常的人生轨迹，他未来会成为一位神职人员。但在大学期间，他偶然读到哲学家皮萨列夫的《动植物的进化》，因此打开一扇前所未有的大门。皮萨列夫在书中对达尔文的进化论进行了详细的介绍，带给巴甫洛夫前所未有的思想冲击。父亲从小在他心中建立的神学观，在这一刹那完全崩塌了。

对自然科学产生了浓厚兴趣后，巴甫洛夫很快又接触到了谢切诺夫所著的《脑的反射》。巴甫洛夫对反射论深信不疑，从此彻底放弃神学研究，投身科学事业。整个一生，他都在对反射论进行孜孜不倦的研究。但他并不因此居功自傲，反而尊称谢切诺夫为俄国生理学之父。

1870年，21岁的巴甫洛夫离开神学院，报考俄国圣彼得堡大学。跨专业报考有一定难度，一开始巴甫洛夫没有进入自己心心念念的自然科学专业，而是进入了难度相对更低的法律专业，经过进一步的努力后才转到了自然科学专业。在这里，生理学教授是谢切诺夫，化学教授是年轻的门捷列夫，巴甫洛夫受到了当时俄国最好的教育。

一开始，巴甫洛夫所修的是物理和数学，并没有什么突出的表现。到了大三，因为上了齐昂教授开设的生理学课程，他开始对生理学实验产生浓厚的兴趣，毅然改变了自己的主修课程，投身到生理学的研究中。

生理学实验需要进行大量的手术，巴甫洛夫通过夜以继日的练习，终于练出了一双灵巧而精准的手。因为任何一场精细的手术都能迅速完成，他也受到齐昂教授的赏识，不仅能经常参与齐昂教授的实验，还能给齐昂教授充当助手，掌握丰富的实践经验。

1874年，在齐昂教授的指导下，巴甫洛夫与同学一起完成了此生的第一篇科学论文《论支配胰腺的神经》，大获成功，得到了大学的金质奖章。