因为学习勤奋，巴甫洛夫大学期间每年都获得了奖学金，但家境贫寒的他却不得不另外当家庭教师来赚取生活费。为了省钱，他甚至每天都要走很远的路，从住处步行到学校上课。哪怕如此，他也没有养成急功近利的性格。

1874年，因为过多的生理学实验耽搁了主修课程，巴甫洛夫主动提出留级一年。第2年，26岁的巴甫洛夫才从圣彼得堡大学毕业，获得生理学学士学位。但如果想进行更深入专业的生理学实验，就必须进一步学习医学知识，巴甫洛夫因此选择进入俄国的第一所军事医学院圣彼得堡军事医学院（今基洛夫军事医学院），继续攻读医学专业。

医学院攻读期间，他有幸成为教授助教，提升了教学能力。1876年之后，他又进入兽医学院生理系，做了两年的实验助理，在心脏和循环系统的研究上积累了大量的实践经验。

巴甫洛夫的研究天赋很快被人所熟知，并得到波特金教授的注意。波特金教授是当时俄国著名的临床医生，拥有自己的一所小医院，他邀请巴甫洛夫前去担任医院的生理实验室责任人。虽然波特金教授的实验室十分简陋，就像澡堂一般，但生活拮据的巴甫洛夫还是答应了下来，并在那里从事了长达十年的研究工作。

有了实验室获得的报酬和医学院期间获得的奖学金，巴甫洛夫的经济情况得到一定程度的改善。1879年，巴甫洛夫获得医学学位，并成功进入军医研究院进行深造。

在研究院深造期间，巴甫洛夫认识了教育学院的女孩谢拉菲玛。虽然谢拉菲玛热爱文学和莎士比亚的戏剧，与一心从事科学事业的巴甫洛夫像是两个世界的人，但他们还是相爱了。经过两年的热恋，他们在1881年步入婚姻的殿堂。谢拉菲玛是一位能力出众的女性，结婚后，她把巴甫洛夫的生活料理得井井有条，让巴甫洛夫能把所有的精力放在研究工作上。

在波特金教授的生理实验室工作期间，巴甫洛夫从事了血液循环、消化生理和药理学方面的各项研究。凭借一双善于做手术的灵活双手，他在进行各类实验的过程中，有了前人从未探索到的一些崭新发现。尤其是在神经系统上，他不仅发现了胰腺的分泌神经，还发现了心脏的营养性神经。这意味着，他开辟了一个前所未有的学科——神经营养学。而他发现的这些神经，也被称为“巴甫洛夫神经”。

1883年，是巴甫洛夫的幸运年，不仅儿子出生了，而且还发表了一篇重要论文《心脏的传出神经支配》。在这篇论文中，他不仅提出了神经性疾病和神经系统营养功能的基本原理，还为循环系统反射调节的基本模式提供了证据。凭借这篇论文，他不仅成功获得医学研究院的医学博士学位，还被聘为军医学院的生理学讲师。

虽然已经获得如此高的成就，但巴甫洛夫并没有停下自己的脚步。1884年，他前往德国莱比锡大学路德维希研究室进修，继续研究心脏搏动的神经机制。通过大量的实验，他提出了一个假说，心脏的跳动节律受到两种不同的肌肉驱动，而这两种肌肉又是受两种不同的神经控制的。虽然巴甫洛夫的认识并不完全正确，却十分具有前瞻性。

在巴甫洛夫进修期间，路德维希研究室还研究了狗的消化，他们把狗的胃部切下一部分来进行研究。虽然研究室并没有得到重要成果，但巴甫洛夫却得到了启发，把相关的实验用在了他未来的研究工作中。