当时，肺结核又名肺痨，是一种严重的传染病，欧洲每年有约1/7人口死于该病。以柏林为例，1/3的新生儿和1/2的25—40岁成年人都死于肺结核，整体死亡原因中有12%都归因于肺结核。面对如此严峻的形势，解决它的重要性不言而喻。当时，关于肺结核的病因存在一定分歧：肺结核的家族性发病特征使部分医生将其看作是一种遗传病；魏尔啸等人认为包括肺结核在内的所有疾病都源于细胞功能障碍；科赫则倾向于认为肺结核是一种由细菌引起的疾病。

科赫需要找到潜在致病菌。他尝试多种细菌染色方法，最终在肺结核患者受感染的组织内观察到大量杆状细菌，而在正常组织内则不存在这种细菌。科赫进一步观察发现，细菌数量与疾病状况密切相关，肺结核活动期患者体内细菌数量多，而稳定期患者体内细菌数量较少。这些证据使科赫将该细菌锁定为致病菌。

下一步，科赫需要实现细菌培养。他发现，相比较于炭疽杆菌，体外培养这种新型细菌较为困难，一方面它生长缓慢，另一方面培养条件苛刻。经过多次筛选后，科赫发现热凝固的绵羊血清是这种细菌理想的培养基，并且37℃到38℃效果最好。最终，他获得了足量的细菌。

最后，科赫还需要证明细菌可导致肺结核。科赫使用体外培养的细菌为217只健康动物进行接种，结果发现动物都不同程度感染上肺结核，且接种细菌数量越多，肺结核症状越严重；相反，如为动物接种不含细菌的物质则不会出现肺结核。科赫从被感染的动物体内分离细菌后，再次将细菌接种给健康动物，结果仍可造成肺结核出现。基于所有数据，科赫认定这种细菌就是导致肺结核的罪魁祸首，并将其命名为结核杆菌。

科赫还从肺结核患者的痰中检测到了结核杆菌，并且用这种痰为健康动物接种也可诱发肺结核，从而说明痰是肺结核传播的重要媒介。这一发现表明，预防肺结核的传播涉及公共卫生问题，可通过对患者衣物进行全面消毒和限制公共场所随地吐痰达到减少肺结核传播的效果。科赫不辞辛劳、夜以继日地工作，最终花费约半年时间解决了肺结核病因这一重大科学问题。

1882年3月24日，科赫在柏林生理学会议上宣布自己的发现：结核杆菌是肺结核的致病菌。这天是值得纪念的日子，标志着人类在战胜重大疾病方面取得第一次突破性进展，被看作医学史上一个分水岭，1982年3月24日纪念科赫发现结核杆菌100周年时，世界卫生组织将这一天命名为“世界结核病日”。1882年4月10日，科赫在著名的《柏林医学周刊》杂志上正式发表名为“结核病病因”的文章。

在结核杆菌的发现过程中，科赫结合自己的老师亨勒及其他科学家思想，提出判定致病菌的一般规则，后来被命名为“科赫法则”：

第一，致病菌必须存在于每位患者中，但不应存在于健康个体。

第二，致病菌必须能从患者体内分离并在体外成功培养。

第三，体外培养的纯致病菌接种到健康动物体内，必须诱导出相同疾病。

1905年，美国植物病理学家欧文·史密斯又补充了一个新要求：第四，必须从被感染的动物体内分离出相同的致病菌。

虽然这些要求不能适用所有情况，但所设定的严格证据链仍成为致病菌鉴定的基本准则，被沿用至今。更重要的是，其基本思想还被其他科学领域的研究借鉴，对推动科学的全面发展具有重要意义。

1883年，科赫被任命为德国霍乱委员会的负责人，全面调查埃及和印度的霍乱疫情，最终于1884年分离并确定霍乱弧菌为霍乱的致病菌。

科赫通过流行病学分析发现，霍乱弧菌造成的水源污染是引发霍乱传播的重要因素，因此提出借助过滤水源而获得清洁水是防止霍乱传播的一个必要条件。这一措施在印度加尔各答的实施，使霍乱发病率明显下降。科赫的这个发现无疑是公共卫生领域的一场重大胜利。