从1901年到1904年，因为对生理学上的突出贡献，巴甫洛夫连续4次获得诺贝尔生理学或医学奖的提名，并在第4次提名时荣获该奖项，时年55岁。

诺贝尔生理学或医学奖的荣誉并没有让巴甫洛夫止步不前。1904年以后，他开始研究自己一生都想要弄清楚的一个问题：究竟是什么东西控制着狗分泌唾液，难道是某种神秘的精神力量？

虽然在50年前就有科学家发现食物和气味能刺激唾液分泌，但并未有任何人知道具体的机制，于是才有了谢切诺夫提出的反射论。巴甫洛夫想要设计一套实验流程，验证这个理论。

通过“假饲”实验积累的丰富经验，巴甫洛夫最终设计出了一套可行的实验流程。狗进食的时候，受到食物和气味的刺激会分泌唾液，这是显而易见的，那通过无关的刺激能否让狗也分泌唾液呢？

巴甫洛夫首先选择的刺激条件，是容易制造的声音。在一些流传的轶事中，巴甫洛夫使用铃铛来制造声音，这是不符合事实的。作为严谨的实验科学家，巴甫洛夫不可能使用铃铛，因为铃铛的声音频率和大小不容易控制，会令实验结果造成偏差。在实验过程中，虽然巴甫洛夫尝试过多种发声工具，但主要是节拍器、蜂鸣器以及风琴。

通过实验，巴甫洛夫发现，在狗进食时反复进行声音刺激，当狗再次听到相同的声音刺激时，即便没有获得食物，也会产生反应，分泌唾液。但如果多次刺激，依然没有获得食物，这种反应就会逐渐减弱。随后，巴甫洛夫又使用了光电等其他刺激，也得到了同样的实验结果。于是他把狗直接通过食物就能分泌唾液的反射称为“无条件反射”，而把固定刺激产生的反射称为“条件反射”。

在随后的30年，巴甫洛夫和助手引入各种不同的变量，建立了比较系统而完善的条件反射理论。他认为低级神经系统控制非条件反射，而高级神经中枢控制条件反射。同时他还提出条件反射综合了多种感官，属于外界刺激和器官之间建立的暂时联系。

巴甫洛夫的贡献，让后世的科学家能在高级神经活动的基础上，对大脑的学习、记忆、睡眠、觉醒、动机和行为等进行深入的研究，从而让我们对大脑和神经系统有了更加全面的了解。

巴甫洛夫曾说，我们必须痛苦地承认，正是因为狗的杰出智慧，且作为人类最优秀的驯养动物，它们才最常被用于生理学实验，成为受害者。然而，慢性实验需要手术恢复后的长期观察，所以狗是不可替代的。我们都应该感谢它们，它们是实验的参与者和贡献者，正是它们的理解和服从，使实验在很大程度上获得了成功。