1851年10月27日，孟德尔成功进入了维也纳大学求学。在第一学期，他就有幸听到著名物理学家多普勒亲自讲授的实验物理学，并成为多普勒的助手。孟德尔不仅学到了全新的物理学知识，也继承了多普勒科学分析的方法：通过实验分析提出假说，根据假说演绎出更多实验方法，再通过反复修正，逐步得到完善的理论。科学分析的方法，令孟德尔未来实验的成功有了基本的保证。

除了多普勒外，孟德尔还遇到了另外一位物理学家埃汀豪森。虽然埃汀豪森在历史上并不著名，但他对孟德尔却有着至关重要的影响。在埃汀豪森身边，孟德尔不仅学习了物理仪器的使用，提高了动手能力，还学习了系统的数理统计，这是当时其他生物学家所不具备的。

数理统计如同一把钥匙，帮助孟德尔彻底打开了现代遗传学的大门。不过把孟德尔推到大门前的，却是另外一名植物学家翁格尔。孟德尔不仅在翁格尔这里学习了系统的植物杂交实验，还掌握了豌豆杂交实验所得的性状分布。

在整个维也纳大学求学期间，勤奋的孟德尔穿梭于各个大学教授和图书馆之间，把所有的时间都花在了学习上。短短两年的时间，他便系统掌握了动物学、植物学、昆虫学、果树学、化学等各个学科的知识。

1853年，31岁的孟德尔从维也纳大学毕业。回到修道院不久，他受到布尔诺高等技术学校校长的邀请，成为该校生物学和物理学的代课老师。1856年，孟德尔再次前往维也纳参加全国教师资格考试，但就在笔试的第一天，他因病退出了考场。从那以后，他再没参加过任何考试。

虽然孟德尔一直以代理老师的身份授课，但他的授课工作和实验演示却非常成功，大受学生的欢迎。

1856年，在授课之余，34岁的孟德尔也如同老师克纳谢尔那样，在修道院内开始了育种实验。在他所处的时代，科学界的主流还是“混合遗传”学说，人们认为，白色的绵羊和黑色的绵羊结合能生下灰色的绵羊。但经历系统学术培养的孟德尔，却敏锐地发现遗传现象或许另有规律。

豌豆的雄蕊和雌蕊闭合在严密的花瓣中，不受风和蜜蜂的干扰，可以通过人工自由操控它的授粉，是研究遗传规律的完美对象。在长35米、宽7米的狭长田地间，孟德尔种满了豌豆。他对每一棵豌豆苗都爱如珍宝，曾指着它们向挚友尼耶塞尔教授说道：“看，这些都是我的儿女！”

这一场遗传实验，孟德尔一做就是长达8年的时间。

在前两年，他从34种豌豆中找到14种明显的性状，分成了7组进行对照实验。数十年后，科学家发现，孟德尔当时选择的7组性状竟然正好位于不同染色体的等位基因上，从而保证了实验的最终结果。如果没有孟德尔细腻的观察，这样看似巧合的事情，其实极难发生。

而后的8年时间内，孟德尔累计测试的豌豆多达28000株，通过反复的播种、授粉、观察、记录和计算，他研究了豌豆不同杂交后代的比率，经过反复验证之后，他终于发现了生物遗传的秘密。

当不同稳定性状的亲本杂交后，往往只显示一种性状的子代，例如红花和白花杂交，产生红花的子代。如果子代再次自花授粉，产生的子二代便会同时出现两种性状，且比例总是接近3:1。例如，红花和白花的子二代中，红花705株，白花224株，比例是3.15:1。把子二代再次进行杂交，得到子三代后，4种类型的分配比例是9:3:3:1，正好是3:1的平方。