在维也纳大学病理解剖学系，兰德斯坦纳的主要职责是负责尸体解剖和病理诊断，十余年间完成近四千次尸检，在提升业务水平的同时，他还有机会开展临床研究，并取得多项突破。

兰德斯坦纳的日常工作之一是借助显微镜观察来确定患者病因。1906年，他和皮肤科同事维克多·穆查在梅毒感染者标本中清晰观察到梅毒螺旋体，从而为临床诊断提供了重要工具。尽管该方法后来被其他方案代替，但在当时对减少梅毒传播具有重要意义。

1908年，兰德斯坦纳成为维也纳威廉敏娜医院病理学主任，这一职位更加有利于他开展临床研究。同年的11月16日，一名9岁男孩由于头痛入住医院，初诊为流感，经常规治疗后症状得到明显改善；然而，两天后患者病情突然加重，出现瘫痪和呼吸窘迫并很快死亡。兰德斯坦纳对这一突发状况极为关心，想知道男孩病情突变的原因，于是和儿科同事欧文·波普尔对患儿进行尸检，根据大脑病理最终确定男孩死于脊髓灰质炎。

脊髓灰质炎，又称“小儿麻痹症”，已被发现几百年，随着20世纪初在美国和欧洲的频繁暴发而令各国不得不加强相关研究。当时的主流观点认为脊髓灰质炎是由某种细菌感染引起的，因此兰德斯坦纳决定找到这种致病菌。遵循科赫法则，兰德斯坦纳首先使用显微镜在患儿神经组织中寻找细菌存在的证据，遗憾的是并未成功。不甘心的兰德斯坦纳又将患儿神经组织制备成匀浆进行体外细菌培养，仍一无所获。兰德斯坦纳将组织匀浆分别注射到兔子、豚鼠、小鼠和猴子体内，这次取得部分成功，前三种动物都健康生活，而被注射的两只猴子不久出现瘫痪症状并死亡，病理报告显示猴子死于小儿麻痹。兰德斯坦纳和波普尔结合这些结果推测，脊髓灰质炎由一种在自然界中比细菌更小的传染性病原体（显微镜无法发现）引起。这一结果于1909年以“急性脊髓灰质炎传播给猴子”为题在《免疫和实验治疗研究杂志》上发表。

兰德斯坦纳推测脊髓灰质炎的病原体应该是由一类比细菌小的生物引起的，而当时符合这种条件的就是病毒。当他准备用实验提供更直接的证据时却遇到麻烦，当时医院只有两只猴子可用，但它们已经死于脊髓灰质炎。为解决这一难题，兰德斯坦纳联系到当时的微生物研究圣地——法国巴斯德研究所，携带材料到法国开展实验。兰德斯坦纳将患病神经组织匀浆先行过滤以完全排除细菌干扰，然后将过滤液再注射到猴子体内，结果使猴子患上脊髓灰质炎，最终确定脊髓灰质炎是一种由病毒引起的传染病，这为进一步的研究奠定了基础，而兰德斯坦纳顺理成章成了脊髓灰质炎病毒的发现者。为表彰这一开创性发现，兰德斯坦纳于1958年被追授进入美国佐治亚州沃姆斯普林斯的脊髓灰质炎名人堂。