1904年，摩尔根再次受威尔逊之邀加入哥伦比亚大学，担任实验动物学教授，研究方向也发生重大转变，原因在于20世纪初的几项重大突破。

1900年，孟德尔的遗传规律被重新发现，遗传学正式诞生。孟德尔以豌豆为材料，发现了遗传的两大定律，即分配定律和自由组合定律。单个性状遗传时第二代会出现3:1分离，此为分配定律；两个性状遗传时第二代出现9:3:3:1比例，此为自由组合定律。摩尔根对此持反对意见，认为这是另一种形式的“预定论”——遗传因子严格决定后代性状而未考虑环境影响。1902年和1903年，萨顿和博维里先后提出了染色体概念，认为决定个体性状的遗传因子（后来称为基因）应该位于染色体上。摩尔根从胚胎发育角度认为这种解释也不合理，所有细胞都含有相同染色体，但最终产生出差异悬殊的组织，如动物的眼睛、翅膀、腿等。摩尔根不赞成当时的主流观点，但也没有直接证据和十足把握，为此他决定用事实进行反驳。

摩尔根与遗传学有着深厚渊源。首先，摩尔根和德弗里斯相识，特别是于1900年造访德弗里斯花园实验室后感触颇深，能够将个人爱好和科学研究融为一体真是人生乐事；其次，摩尔根的挚友威尔逊于1905年发现X染色体，从而激发了摩尔根探索性别决定因素的兴趣。

选择一个理想模式生物[8]是摩尔根开启研究的第一步。孟德尔选用豌豆为材料，而摩尔根以前很少接触植物，更多的是与动物打交道，因此他起初尝试的材料是小鼠和大鼠，但情况极为糟糕。由于他的实验室刚刚建立，空间和经费均不富裕，摩尔根希望能找到一种质优价廉的动物以解燃眉之急。一个偶然的机会，摩尔根知道了果蝇，他敏锐地意识到这可能是最为理想的材料。

果蝇成为遗传学模式生物可谓机缘巧合，也是情理之中。第一，果蝇可由实验室饲养，且饲养技术成熟；第二，它体积小，省空间，成年果蝇仅3毫米左右，一只牛奶瓶就可饲养数百只；第三，果蝇的繁殖力强，十天左右即可繁殖一代；第四，它的染色体比较大，可以在显微镜下清晰地区分性染色体。1908年，摩尔根建立了著名的“果蝇室”，开启人生的高光时刻。

当然，果蝇也存在一些不足，如自发突变就比较困难。摩尔根花费两年时间都没有成功，但功夫不负有心人，幸运最终从天而降。