1918年，第一次世界大战结束，弗莱明回到圣玛丽医院，升任接种科助理主任，开始寻找抗菌物质。其间他还曾调查造成两千多万人死亡的西班牙大流感的原因，遗憾的是无果而终。

弗莱明在实验操作方面并不是一位非常严谨的科学家，而恰恰是这一“特征”使他因祸得福，取得两项重大发现。为了找到抗菌物质，弗莱明需要培养大量细菌，开展大规模筛选。他制备出大量高温灭菌后的培养基，然后倒入同样无菌的培养皿，以备下一步培养细菌之需。1921年底，弗莱明在整理培养皿过程中发现一块培养皿被空气中的细菌污染而产生菌斑，而弗莱明此时恰好患有感冒，他就将鼻涕滴落到这块已经无用的培养皿中，神奇的事情发生了，弗莱明发现鼻涕周围形成了一个清晰透明的圆圈，这表明圈内细菌已经被杀死，而圆圈之外仍是不透明区域，这意味着污染细菌仍然存活。弗莱明对这个结果半信半疑，随后又用培养着细菌的混浊溶液进行测试，结果发现加入鼻涕一段时间后溶液变得澄清透明，说明鼻涕确实具有杀菌作用。

弗莱明推测其他体液可能也具有杀菌功能，他首先将目光转向眼泪。为了收集尽可能多的眼泪，弗莱明鼓励同事积极“捐献”，当洋葱都不足以使同事们产生大量眼泪后，又换用柠檬，后来甚至招募志愿者“捐献”，每份眼泪给予3便士补偿。进一步的测试结果显示，眼泪确实也可杀死细菌。弗莱明进一步拓展测试范围，先后使用唾液、痰、血清、精液和脓液等人体体液证实这一结论，将这种抗菌物质命名为溶菌酶。弗莱明对这个发现欣喜若狂，后来他将其看作自己一生中的最大发现，重要性甚至超过青霉素。1922年5月，弗莱明在《皇家学会会刊B：生物科学》上发表《关于组织和分泌物发现的显著溶菌物质》的文章，然而令他始料未及的是，溶菌酶的发现并未引起其他人的兴趣，因为他们不相信体液中含有可以杀菌的物质，即使有，也没有实际价值。

弗莱明并没有因为同行的漠视而停止溶菌酶的探索步伐，但随后的结果也让他有些丧失信心。弗莱明发现，溶菌酶杀死的更多的是有益菌，而对造成败血症的葡萄球菌等却没有杀伤能力，意味着溶菌酶的治疗价值确实有限。溶菌酶研究的无疾而终让弗莱明有些丧气，但这并未影响他继续寻找抗菌物质的决心。